核酸含量测定

2025-03-26 微析研究院 生物制品检测

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核酸含量测定是生物制品检测中的关键项目，主要用于定量分析样品中DNA或RNA的浓度及纯度，确保产品质量与工艺稳定性。常用方法包括紫外分光光度法、荧光染料法（如PicoGreen、Qubit）及实时定量PCR（qPCR）。该检测广泛应用于基因治疗产品、疫苗、重组蛋白药物等的研发与质控，可评估生产过程中核酸残留、载体浓度及基因表达效率，同时满足药典及监管机构对生物制品安全性与有效性的要求。

核酸含量测定项目介绍

核酸含量测定通过化学或分子生物学手段定量检测样品中核酸（DNA/RNA）的总浓度、纯度及特异性序列含量，是生物制品工艺验证、批次放行及稳定性研究的关键指标。

该项目可区分超螺旋DNA、单链DNA/RNA及降解产物，评估病毒载体滴度、质粒拷贝数或mRNA疫苗有效成分含量。

高灵敏度方法（如ddPCR）可检测痕量核酸残留，满足细胞治疗产品中宿主DNA残留限度的法规要求（如≤10 ng/剂）。

核酸含量测定项目种类

总核酸含量测定：使用A260/A280比值法快速评估样品纯度与浓度，适用于粗提样品初步筛查。

双链DNA特异性检测：采用PicoGreen荧光法选择性结合dsDNA，避免单链核酸干扰。

qPCR绝对定量：通过标准曲线测定特定基因拷贝数，用于腺相关病毒（AAV）载体基因组滴度检测。

数字PCR（ddPCR）：无需标准曲线的绝对定量，适用于低浓度样本（如残留宿主DNA检测）。

核酸含量测定所需样品

液体样本：细胞裂解液、病毒载体悬液、质粒溶液等，体积≥200 μL（浓度建议1-1000 ng/μL）。

冻干粉末：需用无核酸酶水复溶至指定体积，避免反复冻融。

特殊处理要求：含抑制剂样本（如血制品）需备注说明，可能需增加纯化步骤。

核酸含量测定方法步骤

分光光度法：使用Nanodrop检测A260/A280，1 μL样品快速获得浓度与纯度数据。

荧光法流程：加入定量荧光染料（如Qubit试剂），用标准品建立标准曲线后检测样本荧光值。

qPCR操作：设计特异性引物探针，通过Ct值与标准曲线计算目标序列拷贝数。

琼脂糖电泳验证：对争议样本进行电泳分析，判断核酸完整性及是否存在降解。

核酸含量测定依据标准

1、《中国药典》2020年版 三部 3407 核酸残留量测定法

2、USP<1130> Nucleic Acid-Based Techniques

3、ISO 21571:2005 食品中核酸提取与纯化方法

4、ICH Q2(R2) 分析方法验证指导原则

5、EMA指南：基因治疗产品质控要求（EMA/CAT/80183/2014）

6、FDA Guidance for Industry: Gene Therapy Clinical Trials

7、EP 2.6.14 DNA扩增技术应用规范

8、GB/T 37875-2019 核酸提取纯化试剂盒质量评价技术规范

9、ISO 20395:2019 核酸定量用荧光染料性能评估

10、YY/T 1256-2015 体外诊断试剂DNA荧光定量检测通则

核酸含量测定服务周期

常规检测（分光光度法/荧光法）：1-3个工作日（含数据复核）

qPCR/ddPCR检测：5-7个工作日（含引物验证与标准品制备）

方法学验证服务：10-15个工作日（含专属性、线性、精密度等全套验证）

核酸含量测定应用场景

疫苗开发：mRNA疫苗包封率检测、病毒载体基因组滴度测定

生物类似药：宿主细胞DNA残留检测（如CHO细胞DNA≤10 ng/剂）

细胞治疗产品：CAR-T细胞转导效率评估、慢病毒载体拷贝数检测

基因检测试剂盒：参考物质定值、检测限（LoD）验证

科研领域：CRISPR基因编辑效率分析、二代测序文库定量